Μετά την εγκατάσταση των Βενετών στην Κρήτη, το Βατικανό έδιωξε τον Ορθόδοξο Μητροπολίτη Κρήτης και τους Επισκόπους κι εγκατέστησε Λατίνους, Αρχιεπίσκοπο και Επισκόπους. Ωστόσο, οι Ενετοί δεν πείραξαν το ναό του Αγίου Τίτου, ο οποίος παρέμεινε όπως ήταν με τις βυζαντινές εικόνες και τα ορθόδοξα κειμήλια. Μάλιστα, καθώς ήθελαν να φαίνεται ότι συνεχίζουν την εκκλησιαστική παράδοση της Κρήτης, επέτρεπαν ενίοτε στους ορθόδοξους ιερείς να λειτουργούν σύμφωνα με το τυπικό της Ανατολικής Εκκλησίας.

Στα μέσα του 15^ου αιώνα, ο ναός ανακαινίστηκε από το Λατίνο αρχιεπίσκοπο Φαντίνο Ντάντολο καθώς είχε υποστεί μεγάλες καταστροφές από σεισμό. Στο μεγάλο βωμό τοποθετήθηκε η κάρα του Αγ. Τίτου, το λείψανο του Αγίου Στεφάνου, του Αγίου Μαρτίνου και της Αγίας Φωτεινής. Τα εγκαίνια του ναού έγιναν στις 3 Ιανουαρίου 1446.

Ο ναός άντεξε το σεισμό του 1508 χωρίς να χάσει την αρχική του μεγαλοπρέπεια για να υποστεί ανεπανόρθωτες φθορές από την μεγάλη πυρκαγιά στις 3 Απριλίου 1544. Ωστόσο, το 1557 κτίστηκε εκ νέου και έγινε «η αρχαιότατη βασιλική ωραιότατη» (pulcherrima et vetustis operis basilica) όπως αναφέρει ο περιηγητής Jan Van Kootwyck (1598).